Wrodzony zespół defektów neutrofilów związany z mutacjami w VPS45 AD 7

Załadowanie kontrolowano przez immunoblotting tej samej błony dla emeriny, .-aktyny lub .-tubuliny. Densytometria została przeprowadzona za pomocą narzędzia Gel Analysis ImageJ 1.45s (National Institutes of Health). Panel B wykazuje zaburzoną ruchliwość komórek. Fibroblasty hodowano na szkiełku nakrywkowym powleczonym fibronektyną. Kultury zraniono przez wprowadzenie zarysowania (o szerokości około 800 .m) w polu komórek; to samo pole komórek zostało zobrazowane natychmiast, po 6 godzinach i po 12 godzinach. Fibroblasty od Pacjenta B-II-9 migrowały znacznie wolniej w kierunku obszaru zranienia niż komórki kontrolne (podobne wyniki uzyskano w fibroblastach od Pacjenta E-II-1). Każde doświadczenie przeprowadzono trzykrotnie, a podobne wyniki uzyskano w czterech niezależnych eksperymentach. Histogram pokazuje kwantyfikację obszaru zarysowania po 0, 6 i 12 godzinach. Panel C pokazuje analizę cytometrii przepływowej dla integryny CD45 i .1, którą przeprowadzono na krwi obwodowej u pacjenta i kontrolnej. Krew pacjenta (ze zmutowanymi neutrofilami VPS45) ma znacznie mniej komórek, które są pozytywne dla integryny .1. Panel D pokazuje apoptozę w fibroblastach od pacjenta i kontrolnej. Barwienie aktywowanej kaspazy 3, markera izotiocyjanianu fluoresceiny in situ i wskaźnika apoptozy, zwiększono o czynnik 14 w fibroblastach od pacjenta w porównaniu z komórkami kontrolnymi. W panelach A, B i D, prążki T wskazują odchylenie standardowe. Wyciągi fibroblastów od Pacjenta B-II-9 zawierały normalną ilość matrycowego RNA VPS45 (dane nie pokazane). Jednak poziom białka VPS45 we krwi obwodowej wynosił 20% poziomu w kontroli nienaruszonej, a poziom w fibroblastach wynosił około 50% normalnego poziomu (Figura 2A). Immunobloty wykazały również zmniejszone ilości białek oddziałujących z VPS45, rabenosyn-5 i syntaksyny-16 (Figura 2A). Badania immunofluorescencji wykazały, że VPS45 niosący mutację Thr224Asn ma zmniejszoną ilość i był rozpraszająco obecny w cytoplazmie w neutrofilach i fibroblastach pacjenta, w przeciwieństwie do silnej okołojądrowej lokalizacji niezmutowanego VPS45 w normalnych komórkach (Fig. S6 w Dodatku Uzupełniającym) .
Funkcjonalna charakterystyka zmutowanego VPS45
Immunoblot podjednostek NADPH-oksydazy (np. Gp91phox, p22pho, p47phox i p67phox) był prawidłowy (dane nie pokazane). W przeciwieństwie do tego, chemotaksja neutrofilów, oceniana przez stymulację N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalaniną (fMLP), była znacznie zmniejszona w komórkach uzyskanych od Pacjentów A-II-3 i C-II-3 (0 do 4 komórek na pole) w porównaniu z komórkami pochodzącymi od zdrowych osobników kontrolnych (42 do 57 komórek na pole). Ponadto, komórki od Pacjenta B-II-9, które były transformowane przez wirus Epsteina-Barr, nie reagowały normalnie na stymulację przez serię aktywowaną fMLP, aktywowaną przez interleukinę 8 lub zymosanem (dane nie przedstawione)
[przypisy: dentysta Kraków, dentysta płock, stomatologia katowice ]

Tags: , ,

Comments are closed.

Powiązane tematy z artykułem: dentysta Kraków dentysta płock stomatologia katowice